IDT NGS二代測(cè)序文庫(kù)均一化試劑盒

--獲得高度穩(wěn)定且均一化處理的DNA/RNA測(cè)序文庫(kù)

北京云肽生物科技代理的美國(guó)進(jìn)口IDT xGen Normalase 文庫(kù)均一化試劑盒，采用了一種新型酶促文庫(kù)均一化處理技術(shù)，可對(duì)|||umina測(cè)序儀測(cè)序前的DNA或RNA文庫(kù)進(jìn)行均一化處理。通過(guò)IDT文庫(kù)均一化試劑盒，上機(jī)前無(wú)需進(jìn)行單個(gè)文庫(kù)濃度檢測(cè)，可得到優(yōu)化的簇密度和更均衡的文庫(kù)。IDT文庫(kù)均一化處理試劑盒可搭配常規(guī)建庫(kù)實(shí)驗(yàn)流程，不僅能縮短實(shí)驗(yàn)整體的操作時(shí)間，還能提高NGS文庫(kù)上機(jī)濃度的精確性，實(shí)現(xiàn)混合文庫(kù)間測(cè)序數(shù)據(jù)量的均一性。IDT文庫(kù)均一化處理實(shí)驗(yàn)流程包括文庫(kù)的非偏好件選擇、酶均一化反應(yīng)，在文庫(kù)擴(kuò)增中使用帶有Normalase標(biāo)記的引物，可穩(wěn)定得到3倍于目標(biāo)均一化濃度的產(chǎn)量。例如上機(jī)前文庫(kù)濃度需要均一化為2nM或4nM的標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)產(chǎn)量，則IDT均一化反應(yīng)前文庫(kù)濃度至少分別為6nM或12M(20ul體積)。該實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不需要增加額外PCR步驟，僅需將常規(guī)文庫(kù)擴(kuò)增引物替換成帶有Normalase標(biāo)記的測(cè)序通用引物或帶有樣本標(biāo)簽的引物。IDTxGen Normalase 文庫(kù)均一化試劑盒為高通量實(shí)驗(yàn)室提供了快速、可擴(kuò)展的文庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化工作流程。

優(yōu)勢(shì)

①節(jié)省時(shí)間，提高通量：統(tǒng)一的樣本處理過(guò)程，生成平衡均一的混合文庫(kù)；

②減少文庫(kù)測(cè)序差異，降低測(cè)序費(fèi)用：得到更平衡的混合文庫(kù)，允許更多的樣本混合上機(jī)，降低測(cè)序成本；

③適用多種工作流程，設(shè)計(jì)靈活：兼容多種文庫(kù)制備方法，獲得均一平衡的測(cè)序數(shù)據(jù)。

圖.IDT xGen Normalase 文庫(kù)均一化試劑盒的工作流程始于建庫(kù)接頭連接反應(yīng)后，工作流程根據(jù)使用全長(zhǎng)或短接頭而不同。通過(guò)NormalasePCR，將文庫(kù)擴(kuò)增到均一化處理反應(yīng)所需zui低數(shù)量，然后進(jìn)行下游的酶均一化處理。在此過(guò)程中，如連按反應(yīng)中使用全長(zhǎng)接頭，PCR擴(kuò)增需使用帶有Nomalase標(biāo)記的測(cè)序通用引物;如使用非全長(zhǎng)接頭，則需使用帶有Normalase標(biāo)記的樣本標(biāo)簽作為擴(kuò)增引物。將擴(kuò)增好的單個(gè)NGS文庫(kù)分別進(jìn)行15分鐘Normalasel孵育，此反應(yīng)過(guò)程使用酶促法，可以無(wú)偏好性地選擇指定摩爾濃度的NGS文庫(kù)。之后，將每個(gè)文庫(kù)等體積的混合到一管中，進(jìn)行15分鐘Normalase ll孵育，酶促法將每個(gè)NGS文庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化到指定的摩爾濃度。實(shí)現(xiàn)上機(jī)測(cè)序前，得到平衡且均一化的NGS混合文庫(kù)。

一

表.使用lDT Normalase試劑盒將文庫(kù)均一化處理成4nM，上樣濃度為12pM，得到和預(yù)期一致的簇密度(lllumina MiSeq測(cè)序，V2版本試劑)。

二、相比傳統(tǒng)上機(jī)定量方式，可得到數(shù)據(jù)量更均一的混合文庫(kù)

圖、測(cè)試分別來(lái)自于兩名實(shí)驗(yàn)者(n=16/每名實(shí)驗(yàn)者)的32個(gè)樣品，使用IDT xGen DNA Library PrepEZ 試劑盒構(gòu)建文庫(kù)。實(shí)驗(yàn)樣本為NA12878 gDNA，起始量為1~250ng。NormalasePCR后的文庫(kù)使用qPCR方法定量，保證文庫(kù)達(dá)到Normalase反應(yīng)所需zui低閾值。"qPCR":基于qPCR定量結(jié)果，對(duì)文庫(kù)進(jìn)行均一化處理、混樣和測(cè)序;"Normalase":同樣樣品使用Normalase試劑盒，對(duì)文庫(kù)進(jìn)行混樣、均一化處理和測(cè)序。比較兩種方法每種接頭測(cè)序產(chǎn)生數(shù)據(jù)百分比(lllumina Miseq v2的50循環(huán)測(cè)序試劑盒)。結(jié)果顯示:qPCR混含文庫(kù)中文庫(kù)測(cè)序數(shù)量變異系數(shù)(CV)為22.5%，而Normalase混合文庫(kù)池的變異系數(shù)為9.4%(中位線為95%的置信區(qū)間)。

圖.10ngNA12878 gDNA，使用IDT xGen DNA Library Prep EZ試劑盒構(gòu)建96個(gè)文庫(kù)，搭配IDT xGen CDl接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增。文庫(kù)混樣、均一化處理前，使用Qubit定量結(jié)果做等體積的文庫(kù)混樣，之后使用lllumina Miseq V2測(cè)序試劑盒上機(jī)測(cè)序(50個(gè)循環(huán))，通過(guò)每種接頭產(chǎn)生測(cè)序數(shù)據(jù)量百分比進(jìn)行比較。均一化反應(yīng)之前混合文庫(kù)池CV為15.5%，證明Normalase引物的擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好。將相同的文庫(kù)均一化處理到4nM，并使用lllumina Miseq V250循環(huán)測(cè)序試劑盒上機(jī)測(cè)序。均一化處理后，文庫(kù)CV降為7.7%，證明通過(guò)IDT xGen Normalase可得到更加均一化的混合文庫(kù)(中位線為95%置信區(qū)間)。

圖.針對(duì)不同GC%含量基因組細(xì)菌的測(cè)序覆蓋度及冗余率結(jié)果

使用IDT xGen DNALibrary Prep EZ建庫(kù)試劑盒，起始量為100ng DNA，包含三種不同比例混合的參考菌株(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈酶球菌)。片段化DNA至350bp，建庫(kù)時(shí)搭配全長(zhǎng)的Y型接頭進(jìn)行連接，使用Normalase標(biāo)記的通用測(cè)序引物擴(kuò)增3、5或7個(gè)循環(huán)。依據(jù)qPCR定量結(jié)果進(jìn)行文庫(kù)混合，并使用lllumina MiSeq PE150測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，不同GC%含量基因組細(xì)菌的測(cè)序覆蓋度及冗余率沒(méi)有顯著差異。

圖.使用IDT文庫(kù)均一化試劑盒，對(duì)插入片段大小即菌種覆蓋度評(píng)估無(wú)影響

將5ng的MSA-1000樣品(GC%基因組含量不同的10種等比例混合菌株)，用IDT xGen DNA Lilbrary PrepEZ 試劑盒構(gòu)建文庫(kù)，分別用IDT Normalase標(biāo)記引物(紫紅色)和IDT普通引物(藍(lán)色)對(duì)兩個(gè)文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增。使用IDT均一化試劑盒或Qubit將文庫(kù)均一化處理為4nM。進(jìn)行l(wèi)llumina MiniSeq 平臺(tái)高通量上機(jī)(PE-150)測(cè)序。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所構(gòu)建的基因組文庫(kù)中(由不同GC%含量的細(xì)菌組成)，經(jīng)IDT均一化處理的文庫(kù)，仍保持養(yǎng)穩(wěn)定插入片段大小(A)和高基因組覆蓋度(B)。

三、文庫(kù)均一化試劑盒的使用，不影響原有RNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果

平行對(duì)比RNA文庫(kù)進(jìn)行上機(jī)前均一化處理使用IDT文庫(kù)均一化試劑盒(n=2)、GPCR方法(n=2)的效果。4個(gè)RNA-seq文庫(kù)(50ng人腦mRNA樣本)分別使用帶有Normalase標(biāo)記的雙端樣本標(biāo)簽、常規(guī)雙端樣本標(biāo)簽進(jìn)行文庫(kù)制備。將帶有常規(guī)樣本標(biāo)簽的文庫(kù)(標(biāo)記為"1"和"2"號(hào)文庫(kù))，按qPCR定量結(jié)果進(jìn)行文庫(kù)均一化及混樣。將帶有Nomalase標(biāo)記的文庫(kù)(標(biāo)記為"3"和“4號(hào)文庫(kù))，在文庫(kù)制備完成后，搭配IDT文庫(kù)均一化試劑盒，將RNA文庫(kù)均一化處理至4nM，通過(guò)Miniseq(2x150)上機(jī)測(cè)序，證明IDT文庫(kù)均一化試劑盒對(duì)RNA-Seq分析結(jié)果無(wú)影響。將各文庫(kù)均一化處理至4nM后上機(jī)測(cè)序，使用STAR、Picard及RSeQC進(jìn)行比對(duì)、進(jìn)行RNA·sec數(shù)據(jù)分析。韋恩圖結(jié)果顯示，每個(gè)樣本中檢測(cè)到的qian一千個(gè)轉(zhuǎn)錄本結(jié)果沒(méi)有顯著差異。

表.相同RNA文庫(kù)，分別使用qPCR文庫(kù)定量、IDT Normalase文庫(kù)均一化試劑盒進(jìn)行文庫(kù)均一化處理，其RNA·seq數(shù)據(jù)分析結(jié)果比較。由于IDT試劑盒使用非偏好性的酶促方法進(jìn)行文庫(kù)均一化處理，因而兩種文庫(kù)均一化處理有著近似的RNA-seq分析結(jié)果，與預(yù)期相符。

表.相同RNA文庫(kù)，分別使用qPCR文庫(kù)定量、IDT Normalase文庫(kù)均一化試劑盒進(jìn)行文庫(kù)均一化處理，其1000個(gè)高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本分析結(jié)果比較。由于IDT試劑盒使用非偏好性的酶促方法進(jìn)行文庫(kù)均一化處理，因而二者的1000個(gè)高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本RNA-seq分析結(jié)果近似，與預(yù)期相符。

圖.韋恩圖顯示每個(gè)樣本中檢測(cè)到的qian一千個(gè)轉(zhuǎn)錄本結(jié)果沒(méi)有顯著差異

IDT文庫(kù)均一化試劑盒優(yōu)勢(shì)

①可靈活調(diào)整均一化處理后文庫(kù)濃度，只需樣本擴(kuò)增后濃度超過(guò)最少文庫(kù)量閾值，即可保證最終所需文庫(kù)濃度均一化;

②處理后的均一化文庫(kù)濃度為4nM，選擇使用≥6nM均一化工作流程時(shí)，最終文庫(kù)濃度為2nM;

③混合文庫(kù)間測(cè)序變異系數(shù)系數(shù)≤10%;

④試劑盒兼容性強(qiáng)，可兼容全長(zhǎng)測(cè)序接頭或短接頭的建庫(kù)流程;兼容非靶向富集的工作流程，制備的文庫(kù)可直接測(cè)序(如全基因組測(cè)序或全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序);兼容雜交捕獲流程，即靶向富集完成后上機(jī)前的文庫(kù)均一化。需保證均一化反應(yīng)前，有穩(wěn)定的文庫(kù)產(chǎn)量(20μL反應(yīng)體系中文庫(kù)摩爾濃度≥6nM或≥12nM)，以得到標(biāo)準(zhǔn)的2nM/4nM文庫(kù)量;

⑤兼容IDT xGen接頭、IDT xGen Normalase CDl引物、IDT xGen Normalase UDl引物;

⑥兼容IIlumina測(cè)序平臺(tái)，并可獲得一致的測(cè)序結(jié)果。

北京云肽生物科技代理的IDT文庫(kù)均一化試劑盒產(chǎn)品